Il Regno dei Funghi è rimasto un luogo pacifico, grazie alle imprese coraggiose di Mario e Luigi. Tuttavia, il Regno dei Funghi costituisce un ingresso nel Mondo dei Funghi, un luogo in cui non tutto va bene. Bowser ha inviato i suoi sette figli per fare guai in questa terra normalmente pacifica. Come primo ordine del loro incarico, hanno rubato le bacchette magiche reali da ogni paese nel Mondo dei Funghi e le hanno usate per trasformare i re in animali. Mario e Luigi devono recuperare le bacchette magiche reali dai sette figli di Bowser per restituire i re alle loro vere forme. Mentre Mario e Luigi partono per il loro viaggio in profondità nel Mondo dei Funghi, la Principessa Peach e Toad hanno una sola cosa da dire: «Addio, e buona fortuna!»