Simile a Fall of the Foot Clan, il precedente gioco per Game Boy della serie, il giocatore può passare tra le tartarughe prima di ogni livello. Ogni tartaruga ha i propri punti di forza e debolezze. Donatello ha un attacco a distanza molto lungo, ma attacca lentamente. L'attacco di Raphael è veloce ma ha una portata molto corta. Leonardo e Michaelangelo sono ben bilanciati. Quando una tartaruga viene sconfitta, viene catturata dal nemico. Il gioco è finito quando tutte le tartarughe sono catturate. Dopo aver completato un livello, al giocatore viene data l'opportunità di salvare una tartaruga catturata. Se nessuna tartaruga è stata catturata, il giocatore accede invece a un livello bonus. Il gioco presenta diversi elementi di gameplay oltre ai tipici beat 'em up, come schivare enormi massi nei livelli sotterranei, muoversi su skateboard o scalare ascensori aerei, e passa da un classico 2D in cui si cammina solo a sinistra e a destra a un'area più aperta in cui le tartarughe possono camminare ovunque sullo schermo. I boss del gioco sono i soliti cattivi: Bebop e Rocksteady, Baxter Stockman, General Traag, Granitor The Stone Warrior, Krang, Shredder e Super Shredder, anche se, proprio come Fall of the Foot Clan, Krang funge da boss finale. Il gioco offre diverse impostazioni di difficoltà che, a seconda del livello, fanno apparire nemici più potenti o concedono ai boss ulteriori attacchi.