Durante una conferenza stampa tenuta da Bruce Wayne per dichiarare la sua opposizione ad Arkham City, mercenari TYGER lo arrestano e lo rinchiudono ad Arkham City. Hugo Strange rivela la sua conoscenza della doppia identità di Wayne come Batman prima di rilasciarlo tra i criminali della prigione. Mentre Strange si prepara ad avviare il "Protocollo 10", Wayne ottiene l'equipaggiamento tramite un drop aereo da Alfred Pennyworth, permettendogli di diventare Batman. Egli salva per primo Catwoman dall'esecuzione da parte di Two-Face, che spera di guadagnare rispetto uccidendola. Dopo che il Joker tenta di assassinare Catwoman, Batman lo insegue al suo rifugio nella Sionis Steelmill, credendo che il Joker possa conoscere la verità dietro al Protocollo 10. Lì, Batman scopre che le proprietà instabili della formula Titan si stanno mutando nel sangue del Joker, uccidendolo lentamente. Il Joker cattura Batman e gli effettua una trasfusione di sangue, infettandolo con la stessa malattia fatale. Il Joker rivela inoltre che gli ospedali di Gotham sono stati avvelenati dal suo sangue infetto. Disperato di salvare se stesso e i cittadini innocenti, Batman cerca Mr. Freeze, che stava sviluppando una cura ma è stato rapito dal Penguin. Tracciando il Penguin al Cyrus Pinkney National History Institute, Batman sconfigge le sue forze, il mostro Solomon Grundy e infine lo stesso Penguin, prima di liberare Mr. Freeze. Freeze dice a Batman di aver già sviluppato la cura, ma la sua instabilità ne rende inutile l’uso. Batman deduce che le proprietà riparatrici del sangue di Ra's al Ghul possono completare la cura. Batman rintraccia uno degli assassini di Ra's al Ghul nella sua tana sotterranea, portando Batman a una confronto con Ra's e sua figlia Talia, l'ex amante di Batman. Con il sangue di Ra's al Ghul, Freeze è in grado di sviluppare un antidoto, ma viene rubato da Harley Quinn prima che Batman possa usarlo. Quando ritorna dal Joker, Batman lo trova ristabilito. Mentre i due si fronteggiano, Strange attiva Protocollo 10, che si rivela essere un piano per sterminare l’intera popolazione di Arkham City e distruggere l’elemento criminale di Gotham. Le truppe TYGER iniziano ad eseguire i detenuti mentre Strange lancia attacchi missilistici contro gli abitanti di Arkham dalla sua base in Wonder Tower. Un missile colpisce la Sionis Steelmill, seppellendo Batman sotto le macerie. Prima che il Joker possa approfittarne, Talia arriva e gli offre l'immortalità in cambio del risparmio della vita di Batman. Dopo essere fuggito con l’aiuto di Catwoman, Batman è convinto da Alfred di porre fine al Protocollo 10 prima di inseguire Talia e Joker. Batman fa irruzione in Wonder Tower e disattiva Protocollo 10. Ra's al Ghul si rivela essere il vero mandante dietro Arkham City e ferisce mortalmente Strange per aver fallito nel sconfiggere Batman. Con il suo ultimo respiro, Strange attiva "Protocollo 11", l’auto-distruzione di Wonder Tower. Batman e Ra's fuggono, ma Ra's si suicida piuttosto che rischiare la cattura. Joker contatta Batman, minacciando di uccidere Talia a meno che Batman non lo incontri al Monarch Theater. Una volta che Batman arriva, Joker pretende la cura ma viene pugnalato e apparentemente ucciso da Talia mentre è distratto. Talia ammette di aver rubato la cura a Quinn, quando viene uccisa da un secondo Joker, ancora afflitto dalla malattia. Il Joker sano che Talia aveva pugnalato si riattiva in Clayface mutaforma, che si rivela essere stato mascherato da Joker sano per tutto il tempo su richiesta del malato criminale. Batman mette fuori uso Clayface, ma Joker fa esplodere il pavimento del teatro, facendo precipitare Batman nella tana di Ra's qui sotto. Batman distrugge il Lazarus Pit rigenerante di Ra's prima che Joker possa usarlo, e beve una porzione dell'antidoto. Batman esita a curare il suo avversario ma viene attaccato da Joker prima che possa agire, provocando lo schianto accidentale della fiala dell'antidoto. Batman ammette che, nonostante tutto quello che Joker aveva fatto, lo avrebbe comunque salvato. Dopo che Joker soccombe finalmente alla sua malattia e muore, Batman trascina il suo corpo fuori da Arkham City. Mentre il Commissario Gordon chiede cosa sia successo, Batman posiziona il corpo di Joker sul cofano di una macchina della polizia e se ne va in silenzio.