Il gioco si apre immediatamente dopo gli eventi di Halo: Reach, mentre la Pillar of Autumn esce dall’iper-spazio vicino a una misteriosa stazione spaziale a forma di anello, chiamata "Halo" dai Covenant nel gioco. Una flotta Covenant attacca e danneggia gravemente il Pillar of Autumn. Il Capitano Keyes avvia 'The Cole Protocol', una procedura che distrugge tutti i dati di navigazione ed è progettata per impedire ai Covenant di apprendere la posizione della Terra. Master Chief e Cortana fanno strada verso una capsula di salvataggio, da cui si espellono dall’astronave insieme a un gruppo di Marines. Mentre se ne vanno, vedono Keyes cercare di far schiantare la Pillar of Autumn su Halo. Master Chief e Cortana sono gli unici superstiti dello schianto della loro capsula, ma presto contattano altri superstiti e li raccolgono in una forza di combattimento. I superstiti riferiscono loro che Keyes è sopravvissuto all’impatto della Pillar of Autumn, ma è stato catturato dai Covenant e tenuto a bordo della nave Covenant Truth and Reconciliation. Master Chief e una forza di Marines salgono a bordo della nave e salvano Keyes, che ordina al Master Chief di precedere i Covenant al centro di controllo di Halo e di scoprire lo scopo di Halo. Master Chief e Cortana si dirigono in una sala mappa chiamata Silent Cartographer, che li conduce alla sala di controllo. Là, Cortana entra nei sistemi e, scoprendo qualcosa di urgente, invia improvvisamente Master Chief a trovare il Capitano Keyes mentre lei resta indietro. Keyes stava cercando ciò che credeva fosse un deposito di armi potenti, ma quando arriva sul posto Master Chief trova solo segni di una battaglia e una registrazione che rivelano di aver accidentalmente liberato i Flood, una razza aliena parassita capace di diffondersi infestando altri esseri senzienti. Il rilascio dei Flood spinge il monitor AI di Halo, 343 Guilty Spark, a reclutare Master Chief per recuperare l’Index, un dispositivo che attiverà Halo e impedirà ai Flood di diffondersi oltre l’impianto. Dopo che Master Chief recupera e si prepara a usare l’Index, Cortana riappare e lo avverte contro l’attivazione. Ha scoperto che il sistema difensivo di Halo è un’arma progettata per uccidere tutta la vita senziente della galassia, il che negherà ai corpi ospiti i mezzi necessari ai Flood per diffondersi, una rivelazione che 343 Guilty Spark conferma. Con queste informazioni, Master Chief e Cortana decidono di distruggere Halo per impedire la sua attivazione. Mentre combattono i Flood, i Covenant e le Sentinelle di Guilty Spark, Cortana scopre che il modo migliore per ottenere questo è provocare l’autodistruzione della Pillar of Autumn, ormai schiantata. Tuttavia, è necessaria l’autorizzazione del Capitano Keyes per distruggere la Pillar of Autumn, costringendo Master Chief e Cortana a tornare sull’ormai infestata dal Flood Truth and Reconciliation per cercarlo. Quando finalmente raggiungono Keyes, però, egli è stato infettato dal Flood oltre il punto di non ritorno. Master Chief recupera direttamente gli impianti neurali di Keyes dal suo cervello e si rifugia sulla Pillar of Autumn, dove Cortana attiva la sequenza di autodistruzione della nave. Tuttavia, 343 Guilty Spark riappare e disattiva il conto alla rovescia, scoprendo nel processo il registro della storia umana. Master Chief destabilizza manualmente i reattori di fusione della Pillar of Autumn, e lui e Cortana sfuggono di poco alla distruzione dell’anello a bordo di un caccia. Cortana esamina lo spazio circostante e scopre che sono apparentemente gli unici sopravvissuti. Cortana ritiene che sia finita, ma il Master Chief le dice che stanno appena cominciando. In una breve scena dopo i titoli di coda, 343 Guilty Spark è visto fuggire dalla distruzione di Halo e nell’ignoto dello spazio profondo.