DJ Hero simula principalmente il turntablismo, uno stile musicale utilizzato dai DJ per creare una nuova canzone mashup incorporando una o più canzoni registrate precedentemente su giradischi insieme a generatori di effetti sonori. Il gioco presenta una modalità di punteggio di tipo score attack, simile ai giochi Guitar Hero. Il controller consiste in un deck wireless composto da un giradischi mobile che supporta 3 pulsanti "stream", una manopola degli effetti, un crossfader e un pulsante "Euphoria"; un pannello nascosto contiene pulsanti aggiuntivi del controller per interagire con la console di gioco al di fuori del gioco. Una parte del controller può essere smontata e riattaccata per adattare l'unità ai giocatori mancini. Le note viaggiano su un arco attraverso un disco che ruota sullo schermo, e il giocatore tiene premuto uno dei 3 pulsanti "stream" per suonare le note; due pulsanti riflettono le due canzoni utilizzate in quel particolare mix, e il terzo rappresenta campioni da aggiungere al mix che possono essere regolati con la manopola degli effetti. Il giocatore deve anche regolare costantemente il crossfader per abbinare i simboli sullo schermo, il che modifica il volume relativo delle canzoni per portare una canzone in primo piano del mix per un breve periodo. Alcuni brani sono mostrati sullo schermo come una serie di frecce rivolte verso l'alto o verso il basso, rappresentanti le sezioni di scratching, richiedendo al giocatore di ruotare il giradischi nella direzione delle frecce tenendo premuto il pulsante per segnare punti, simulando lo scratching dell'ago del vinile sui dischi in vinile. "Euphoria" è equivalente al Star Power di Guitar Hero, raccolto completando con successo frasi specifiche nel mix della canzone, chiamate Perfect Regions, e può essere attivato premendo il pulsante "Euphoria", raddoppiando il moltiplicatore attuale del giocatore nonché il crossfading automatico quando attivo. C'è anche una barra di "Rewind" che si riempie attraverso prestazioni costanti di successo e una volta piena permette al giocatore di riavvolgere la canzone per correggere errori nell'esecuzione. Il giocatore deve continuare a esibirsi bene o la propria barra delle prestazioni diminuirà e la traccia musicale si interromperà. Fallire la canzone non è possibile, a differenza dei giochi Guitar Hero. Una modalità carriera per giocatore singolo è disponibile, così come modalità multiplayer competitiva e cooperativa ("DJ vs DJ"), giocabili localmente o da remoto. Dieci canzoni sono state appositamente mixate per supportare anche il gameplay con Guitar Hero e altri controller per chitarra compatibili in una modalità "DJ vs Guitar". I giocatori possono anche utilizzare un microfono per un'aggiunta non punteggiata al mix. Una modalità Party Play consente al gioco di riprodurre automaticamente le canzoni con la possibilità per un giocatore di entrare e suonare in qualsiasi momento.