Desmond Miles, un barista, viene rapito dall'azienda Abstergo Industries per essere usato come soggetto di prova nell'Animus, un dispositivo che può simulare la memoria genetica. Abstergo intende introdurre Desmond nel dispositivo per richiamare i ricordi del suo antenato, Altaïr Ibn-La'Ahad, un membro della Fratellanza degli Assassini nel 1191, che visse durante la Terza Crociata nella Terra Santa. Inizialmente, Desmond ha difficoltà ad adattarsi al dispositivo, ma alla fine rivive le imprese di Altaïr nei giorni successivi. Il gioco cambia poi principalmente al punto di vista di Altaïr, con transizioni occasionali a Desmond, a causa di problemi con l'Animus o dell'insorgenza dell'Effetto di sanguinamento. Il gioco inizia con Desmond che entra nella memoria di Altaïr, ma presto affronta problemi di sincronizzazione. In questo, si possono udire le voci di Lucy Stillman e Warren Vidic, che discutono sulla sicurezza di Desmond all'interno dell'Animus. Dopo aver riscontrato alcuni problemi, Desmond esce dalla macchina virtuale e Vidic gli fornisce un briefing sul funzionamento interno dell'Animus, prima di avviare il programma tutorial della macchina. Dopo che Desmond ha terminato il tutorial, entra nella memoria sincronizzabile più vicina ad Altaïr; Lucy aggiunge che Desmond deve rivivere momenti chiave della vita di Altaïr per aumentare la sua sincronizzazione, prima di raggiungere la memoria finale che contiene l'informazione che Abstergo sta cercando. Altaïr è mostrato inizialmente nel tentativo di recuperare uno dei Pezzi dell'Eden da quello che è noto come i Pezzi dell'Eden dal Tempio di Salomone con l'aiuto di Malik Al-Sayf e suo fratello Kadar, ma vengono ostacolati da Robert de Sablé, Gran Maestro dei Cavalieri Templari e acerrimo nemico degli Assassini. Mentre recuperano il tesoro, Altaïr infrange tutti e tre i precetti del Credo degli Assassini nel tentativo di uccidere Robert, ma fallisce. Nella successiva confusione, il fratello di Malik viene ucciso, e il braccio sinistro di Malik è menomato e in seguito amputato. Quando Altaïr torna alla roccaforte degli Assassini a Masyaf con le scuse, Malik, che è sopravvissuto a de Sablé, ritorna con l'artefatto e dileggia Altaïr a causa della sua arroganza. Dopo aver quasi sconfitto un attacco di ritorsione dei Templari, Al Mualim, capo degli Assassini, retrocede Altaïr a novizio ma gli dà un'altra possibilità di ascendere tra le fila della Fratellanza. Al Mualim assegna ad Altaïr il compito di assassinare nove figure chiave in tutta la Terra Santa a Gerusalemme, Acre e Damasco, con l'obiettivo di portare pace tra le forze crociate e saracene. Ogni bersaglio si basa su una figura storica reale della Terza Crociata, tra cui Majd Addin, Garnier de Naplouse, Jubair al Hakim, Abu'l Nuqoud, Sibrand, Guglielmo di Montferrat, e Robert de Sablé. Altaïr completa ciascun incarico, apprendendo come ogni bersaglio sia collegato a Robert e ai Templari e come insieme mirino a porre fine alle Crociate e a mettere la Terra Santa sotto loro controllo. Con uomini da entrambe le parti morti, scopre che l'ultimo piano di Robert è tentare di unire le forze cristiane e musulmane contro il loro nuovo nemico comune, gli stessi Assassini. Altaïr sconfigge de Sablé davanti a Riccardo Cuor di Leone, non riuscendo a convincere il Re che una fine della guerra sarebbe ben accetta per entrambe le parti, ma mettendo fine al piano di Robert. Da de Sablé, Altaïr scopre che Al Mualim era lui stesso un membro dei Templari e aveva usato l'Assassino per uccidere gli altri membri che detenevano il segreto del potere dell'artefatto, in modo da poter custodire egoisticamente l'oggetto per sé. Altaïr torna rapidamente a Masyaf e si avvicina al suo maestro, che gli rivela la verità: il Pezzo dell'Eden, che aveva recuperato con l'aiuto di Altaïr poco prima della sua trasgressione, crea illusioni. Denuncia la religione e altri eventi apparentemente sovrannaturali (ad es. la separazione delle acque del Mar Rosso e la presenza degli dèi greci nella Guerra di Troia) come illusioni causate dal Pezzo, e poi afferma la sua intenzione di usare l'artefatto per costringere l'umanità in uno stato di lavaggio del cervello, e così ponendo fine a ogni conflitto; Altaïr è infine in grado di vedere attraverso gli inganni creati dall'artefatto per uccidere Al Mualim. Quando Altaïr recupera l'artefatto, il Pezzo dell'Eden si attiva, mostrando una visione olografica del mondo con numerose posizioni di altri Pezzi dell'Eden segnati in tutto il globo. Quando il processo è completo, Desmond scopre che Abstergo è una facciata moderna dei Templari e stanno già cercando altri artefatti in luoghi identificati nei ricordi di Altaïr. Inoltre, scopre che gli Assassini moderni avevano tentato di salvarlo prima che il ricordo fosse completato ma avevano fallito. A seguito di ciò, Desmond doveva essere ucciso su ordine di un templare di alto rango, Alan Rikkin, ma Lucy Stillman lo salva dalla morte e, a un certo punto, gli infila l'anulare della mano sinistra nella palma, riferendosi alla tradizione degli Assassini di tagliarsi un dito. Anche se Desmond resta intrappolato nel laboratorio di Abstergo, la sua esperienza nell'Animus ha creato un Effetto di sanguinamento della vita di Altaïr nella sua, permettendo a Desmond di usare la Visione d'Aquila di Altaïr, che, a sua volta, gli permette di vedere messaggi strani dipinti sulle pareti della sua stanza e sul pavimento del laboratorio. I messaggi trattano tutte forme di fine del mondo provenienti da diverse culture, includendo riferimenti al 21 dicembre 2012, la data in cui Abstergo prevede di lanciare un satellite che porrà fine alla guerra. Si ipotizza che questo metodo sarebbe lo stesso metodo usato da Al Mualim per ipnotizzare Masyaf, solo su scala maggiore. Infine, il gioco si conclude con Desmond che si chiede cosa significano le immagini e chi potrebbe averle disegnate.