Desmond Miles, un barman, viene rapito dall'azienda Abstergo Industries per essere usato come soggetto di test nell'Animus, un dispositivo che può simulare la memoria genetica. Abstergo intende inserire Desmond nel dispositivo per richiamare i ricordi del suo avo, Altaïr Ibn-La'Ahad, un membro della Fratellanza degli Assassini nell'anno 1191, che visse durante la Terza Crociata nella Terra Santa. Inizialmente, Desmond ha difficoltà ad adattarsi al dispositivo, ma alla fine rivive le imprese di Altaïr nei giorni successivi. Il gioco passa quindi principalmente al punto di vista di Altaïr, con occasionali transizioni a Desmond, a causa di problemi con l'Animus o dell'insorgenza dell'Effetto di sanguinamento. Il gioco si apre con Desmond che entra nella memoria di Altaïr, ma presto si trova ad affrontare problemi di sincronizzazione. Si odono allora le voci di Lucy Stillman e Warren Vidic, che discutono della sicurezza di Desmond all'interno dell'Animus. Dopo aver riscontrato alcuni problemi, Desmond esce dalla macchina virtuale e Vidic lo informa sul funzionamento interno dell'Animus, prima di avviare il programma tutorial della macchina. Dopo che Desmond ha terminato il tutorial, entra nella memoria sincronizzabile più vicina di Altaïr; Lucy aggiunge che Desmond deve rivivere momenti chiave della vita di Altaïr per aumentare la sua sincronizzazione, prima di raggiungere l'ultima memoria che contiene l'informazione che Abstergo sta cercando. Altaïr è mostrato per la prima volta nel tentativo di recuperare uno dei Pezzi dell'Eden da Tempio di Salomone con l'aiuto di Malik Al-Sayf e di suo fratello Kadar, ma vengono fermati da Robert de Sablé, Gran Maestro dei Templari e nemico giurato degli Assassini. Mentre recuperano il tesoro, Altaïr infrange tutti e tre i precetti del Credo degli Assassini nel tentativo di uccidere Robert, ma alla fine fallisce. Nella successiva confusione, il fratello di Malik viene ucciso, e il braccio sinistro di Malik viene paralizzato e in seguito amputato. Quando Altaïr torna alla roccaforte degli Assassini a Masyaf con delle scuse, Malik, che è sopravvissuto a de Sablé, torna con l'artefatto e disprezza Altaïr a causa della sua arroganza. Dopo aver sconfitto a stento un attacco di ritorsione dei Templari, Al Mualim, leader degli Assassini, demote Altaïr a novizio ma gli dà un'altra possibilità di salire di rango nella Fratellanza. Al Mualim assegna ad Altaïr il compito di assassinare nove figure chiave nella Terra Santa, a Gerusalemme, Acri e Damasco, con l'obiettivo di portare la pace tra le forze crociate e saracene. Ogni bersaglio si basa su una figura storica reale della Terza Crociata, tra cui Majd Addin, Garnier de Naplouse, Jubair al Hakim, Abu'l Nuqoud, Sibrand, Guglielmo di Montferrat e Robert de Sablé. Altaïr completa ogni compito, imparando come ogni bersaglio sia collegato a Robert e ai Templari e come insieme mirino a porre fine alle Crociate e a mettere la Terra Santa sotto il loro controllo. Con la morte di uomini su entrambi i lati, scopre che l'ultimo piano di Robert è tentare di unire le forze cristiane e musulmane contro il loro nuovo nemico comune, gli stessi Assassini. Altaïr sconfigge de Sablé davanti a Riccardo Cuor di Leone, fallendo nel convincere il Re che una fine della guerra sarebbe ben accetta da entrambe le parti, ma riuscendo a fermare il complotto di Robert. Da de Sablé, Altaïr scopre che Al Mualim era lui stesso un membro dei Templari e che utilizzò l'Assassino per uccidere gli altri membri che detenevano il segreto del potere dell'artefatto, così da poter tenere l'artefatto per sé. Altaïr ritorna rapidamente a Masyaf e si avvicina al suo maestro, che gli rivela la verità: il Pezzo dell'Eden, che aveva recuperato con l'aiuto di Altaïr poco prima della sua trasgressione, crea illusioni. Denuncia la religione e altri eventi apparentemente sovrannaturali (ad es. le Dieci Piaghe d'Egitto, la separazione del Mar Rosso e la presenza degli dei greci nella Guerra di Troia) come illusioni causate dal Pezzo, e poi dichiara la sua intenzione di usare l'artefatto per costringere l'umanità a uno stato di lavaggio cerebrale e, così facendo, porre fine a tutte le guerre; Altaïr è infine in grado di vedere attraverso le illusioni create dall'artefatto per uccidere Al Mualim. Quando Altaïr recupera l'artefatto, il Pezzo dell'Eden si attiva, mostrando una visione olografica del mondo con numerose località di altri Pezzi dell'Eden segnate in tutto il globo. Quando il processo è completo, Desmond scopre che Abstergo è una facciata moderna dei Templari, e che stanno già cercando altri artefatti in località identificate nei ricordi di Altaïr. Inoltre, scopre che gli Assassini moderni avevano tentato di salvarlo prima che la memoria fosse completata ma avevano fallito. In seguito, Desmond doveva essere ucciso su ordine di un Templare di alto rango, Alan Rikkin, ma Lucy Stillman lo salva dalla morte e, a un certo punto, infila l'anulare nel palmo, riferendosi alla tradizione degli Assassini di tagliarsi un dito. Pur rimanendo intrappolato nel laboratorio di Abstergo, l'esperienza di Desmond nell'Animus ha generato un Effetto di sanguinamento della vita di Altaïr nella sua, permettendo a Desmond di usare la Visione dell'Aquila di Altaïr, che a sua volta gli permette di vedere strani messaggi dipinti sulle pareti della sua stanza e sul pavimento del laboratorio. I messaggi trattano varie forme di fine del mondo provenienti da culture diverse, includendo riferimenti al 21 dicembre 2012, data in cui Abstergo prevede di lanciare un satellite che porrà fine alla guerra in modo permanente. Sembra che questo metodo sarebbe lo stesso utilizzato da Al Mualim per ipnotizzare Masyaf, ma su scala maggiore. Infine, il gioco si conclude con Desmond che si chiede cosa significano tutte le immagini e chi possa averle disegnate.