Cacciatore di tesori Nathan "Nate" Drake (Nolan North), accompagnato dalla giornalista Elena Fisher (Emily Rose), recupera la bara del suo antenato autoproclamatosi Sir Francis Drake, avendola localizzata grazie a coordinate incise su un cimelio di famiglia: un anello che Nate porta al collo. La bara contiene il diario di Sir Francis Drake, che indica la posizione di El Dorado. I pirati attaccano e distruggono la barca di Nate, ma l'amico e mentore di Nate, Victor "Sully" Sullivan (Richard McGonagle), li salva nel suo aereo idrovolante. Temendo che la cronaca di Elena attirerà rivali potenziali, Nate e Sully la abbandonano a un molo. Seguendo il diario fino al punto indicato, Nate e Sully scoprono un alcova che un tempo ospitava una grande statua, e si rendono conto che El Dorado non è una città ma un idolo dorato. Trovano un U-boot nazista, che contiene una pagina del diario di Drake che mostra che la statua fu portata su un'isola. Tuttavia, mercenari guidati dal criminale Gabriel Roman (Simon Templeman) e dal suo luogotenente Atoq Navarro (Robin Atkin Downes) intercettano Nate e Sully. Sully sembra essere stato ucciso da un colpo al petto, ma Nate riesce a scappare, incontra Elena e vola con lei verso l'isola. Durante il tragitto, il fuoco antiaereo costringe Elena e Nate a lanciarsi e si separano. Dopo aver recuperato le provviste dal velivolo idrovolante distrutto, Nate si dirige verso una vecchia fortezza per trovare Elena. Vengono brevemente catturati dai pirati guidati dal vecchio socio Eddy Raja (James Sie); Elena libera Nate e fuggono verso l'antica casa doganale dell'isola. Dopo aver trovato registri che mostrano che la statua è stata spostata più all'interno, scoprono che Sully è vivo e accompagna Roman e Raja. Nate ed Elena trovano e salvano Sully che, avendo sopravvissuto grazie al diario di Drake che ha deviato il proiettile, spiega di aver guadagnato tempo per Nate fornendo a Roman informazioni fuorvianti.