Portable Ops si svolge nel 1970, sei anni dopo Metal Gear Solid 3: Snake Eater. Segue il soldato Naked Snake (David Hayter/Akio Ōtsuka) che è costretto a combattere contro la sua ex unità, FOX, dopo che istigano una rivolta in una base del Sud America. Nella sua lotta incontra Roy Campbell (David Agranov/Toshio Furukawa), un membro sopravvissuto del team dei Green Berets inviato a investigare sull'affare. I vecchi compagni di Snake, tra cui il suo ufficiale comandante Major Zero (Jim Piddock/Banjō Ginga), Para-Medic (Heather Halley/Houko Kuwashima) e Sigint (James C. Mathis III/Keiji Fujiwara), tornano come gruppo di supporto poiché sospettati di tradimento insieme a Snake. Il principale antagonista è Gene (Steven Blum/Norio Wakamoto), l'attuale comandante dell'unità FOX che cerca di stabilire la propria nazione militare. È un prodotto del Successor Project che mirava a creare artificialmente il comandante perfetto, modellato su The Boss. È assistito dal tenente Cunningham (Noah Nelson/Daisuke Gōri), esperto di tecniche di interrogatorio, che in seguito si scopre essere un doppio agente del Pentagono inviato a screditare la reputazione della CIA. Gene ha anche una protetta di nome Elisa (Tara Strong/Saori Goto) che si crede dotata di straordinarie abilità psichiche, presumibilmente il risultato dell'esposizione alle radiazioni nucleari durante il disastro di Kyshtym. Elisa soffre di disturbo dissociativo dell'identità e ha sviluppato una seconda personalità chiamata Ursula', le cui abilità psichiche sono più forti della personalità 'Elisa'. Come 'Ursula', lavora come membro di FOX, mentre la personalità 'Elisa' è una medic(a) che si occupa di Null e un'informatrice per Snake. Snake incontra Elisa, che inizialmente gli dice che lei e Ursula sono sorelle gemelle, per poi scoprire la verità. Due membri di FOX precedentemente associati a Snake includono Null (Larc Spies/Jun Fukuyama), un assassino adolescente addestrato per essere il soldato perfetto, e Python (Dwight Schultz/Yusaku Yara), un vecchio compagno di battaglia di Snake che all'epoca si pensava fosse morto durante la guerra del Vietnam. Altri personaggi includono Ghost (Brian Cummings/Naoki Tatsuta), un informatore che entra in contatto con Snake, rivelando l'esistenza di ICBMG, il nuovo prototipo di Metal Gear, Ocelot (Josh Keaton/Takumi Yamazaki), un ex Maggiore delle Spetsnaz che assiste Gene di nascosto, EVA (Vanessa Marshall/Misa Watanabe), una spia per la PLA che assistette Snake in Snake Eater, e Raikov (Charlie Schlatter/Kenyu Horiuchi), un Maggiore GRU. Teliko Friedman (Kari Wahlgren/Yūko Nagashima) e Venus (Kathryn Fiore/Rika Komatsu), le eroine di Metal Gear Acid e Metal Gear Acid 2 rispettivamente, possono entrambe essere aggiunte alla squadra del giocatore tramite: o il completamento di determinate missioni secondarie, o avviando una seconda partita con i dati di salvataggio dei loro rispettivi giochi.