La trama del gioco inizia con un livello di tutorial in cui Spider-Man impedisce agli H-Bombers di far esplodere l'edificio Carlyle. Il giorno seguente, indaga su strane creature simili a lucertole a Central Park e continua a combattere gli H-Bombers, ostacolando i loro tentativi di distruggere lo Stabilimento di Stampa e l'Ufficio Regionale del Daily Bugle. Quella notte, mentre è in compagnia di Mary Jane a Central Park, un simbionte alieno proveniente da una meteora si attacca alla scarpa di Peter. Dopo aver portato Mary Jane a casa, Peter viene aggredito da Harry, che è diventato il "New Goblin" per vendicare la morte del padre. Peter sconfigge Harry, lo porta in ospedale e poi torna a casa, dove il simbionte lo avvolge, creando un costume nero di Spider-Man che potenzia le sue abilità e ne aumenta l'aggressività. Nel frattempo, un detenuto evaso di nome Flint Marko diventa il Sandman dopo un incidente con un acceleratore di particelle sperimentale che lo fonde con la sabbia. Il giorno successivo, gli H-Bombers attaccano il Daily Bugle e rapiscono J. Jonah Jameson, ma Spider-Man lo salva. Poi affronta e sconfigge il leader degli H-Bombers, Luke Carlyle, un uomo d'affari diventato criminale a causa di una storia pubblicata da Jameson che rovinò la sua azienda. Più tardi, Peter indaga sulla scomparsa del suo professore di scienze, il Dott. Curt Connors, e scopre che si è trasformato in Lizard attraverso esperimenti con un siero di DNA di lucertola. Inseguendo Lizard attraverso le fogne, Spider-Man scopre che ha trasformato anche altri in creature simili con piani per invadere New York. Spider-Man impedisce il piano ma Lizard sfugge più a fondo nelle fogne. Quando Spider-Man lo incontra di nuovo, Lizard è in lotta con Kraven the Hunter. Spider-Man interviene e sconfigge Kraven prima di sopraffare la Lizard e riportare Connors alla sua forma umana. Mentre Spider-Man cura le altre vittime della trasformazione in Lizard, Connors lo aiuta a indagare sul potenziale pericoloso del simbionte dopo essersi completamente ripreso. Un incarico di Jameson porta Spider-Man ad affrontare un vampiro, che sconfigge e conduce da Connors. Connors identifica il vampiro come il Dott. Michael Morbius, un rinomato biochimico. Morbius sostiene che la sua trasformazione sia stata causata dalla moglie Shriek, che Spider-Man rintraccia e sconfigge. Tuttavia, lei fugge, e Spider-Man in seguito combatte la gang di Shriek, i Waste Tribe. Alla fine localizza Shriek e porta Morbius da lei nella speranza di una cura, ma lei mette Morbius contro Spider-Man. Dopo aver sconfitto Morbius, Spider-Man affronta Shriek, usando il simbionte per contrastarne i poteri. Sconfitta, Shriek usa le sue abilità per curare Morbius prima di crollare in coma. Spider-Man la lascia alle cure di Morbius e Connors e se ne va. Più tardi, Peter scopre che Eddie Brock ha finto di essere Spider-Man con la tuta nera per incastrarlo come criminale e ottenere una promozione. Dopo aver umiliato Brock come Spider-Man, Peter mette in luce lo stratagemma e ottiene la promozione, costringendo Brock a giurare vendetta sia contro Spider-Man sia contro Peter. Man mano che il pubblico diventa sempre più allarmato dalle tendenze violente di Spider-Man mentre indossa la tuta del simbionte, Spider-Man decide di ritirarla. Tuttavia, intravede Marko mentre ruba un furgone blindato e lo insegue nella metropolitana. Incapace di sconfiggere Marko, Spider-Man indossa la tuta del simbionte e viene infine sopraffatto dalla sua aggressività. Scoprendo l’acqua come punto debole di Marko, Spider-Man apre una tubazione, liberando acqua che disintegra Marko in fango. Quella notte, l’influenza del simbionte su Peter spaventa Mary Jane durante il loro appuntamento e durante un confronto con dei rapinatori. Peter realizza che l’influenza del simbionte ha un impatto negativo sul suo comportamento e si dirige verso una chiesa vicina per rimuoverlo. Riesce grazie alle vibrazioni sonore della campana della chiesa, che indeboliscono il simbionte. Tuttavia, la creatura si lega a Brock, che aveva seguito Spider-Man fino alla chiesa. Come Venom, Brock, consapevole dell’identità di Peter come Spider-Man, ricatta Marko affinché lo aiuti a uccidere Spider-Man minacciando la figlia di Marko. Rapiscono Mary Jane per attirare Spider-Man, ma Harry, ora ristabilitosi, interviene in loro aiuto. Harry salva Mary Jane e la figlia di Marko e aiuta Spider-Man a sconfiggere Marko prima che Venom provi a ucciderlo. Spider-Man sconfigge Venom usando vibrazioni sonore per indebolirlo, ma Brock presumibilmente muore mentre il simbionte lascia il suo corpo. A seguito di questi eventi, Spider-Man si riconcilia con Mary Jane e Marko viene riunito con sua figlia. Si scusa con Spider-Man e se ne va pacificamente. Il gioco si conclude con Spider-Man che riprende la sua continua lotta contro la criminalità, sottolineando che il miglior modo per onorare e ricordare i propri cari è non smettere mai di essere Spider-Man.