Preparati per una storia così epica da poter svolgersi solo nei corridoi del museo più grande del mondo: the Smithsonian Institution. Il guardiano del museo diventato imprenditore Larry Daley scopre che le sue esposizioni preferite, e alcuni dei suoi migliori amici, provenienti dal Natural History Museum di New York, stanno per essere spediti negli archivi dello Smithsonian. Larry riceve una chiamata di soccorso dal cowboy in miniatura Jedediah, riferendo che il sovrano egiziano Kahmunrah e un trio di loschi scagnozzi—ossia Ivan the Terrible, Napoleon e Al Capone—stanno tramando di prendere il controllo del museo, poi del mondo. Mentre si dirige a tutta velocità verso la capitale della nazione, Larry è chiaramente oltre la sua portata. Ma con alcuni nuovi compagni davvero impressionanti, tra cui l'irrefrenabile Amelia Earhart, insieme agli amici di sempre Teddy Roosevelt e Octavius, Larry non si fermerà davanti a nulla per ripristinare lo Smithsonian prima dell'alba.