Dopo che il Joker assale il Gotham City Hall, viene catturato da Batman e portato all'Arkham Asylum, che temporaneamente ospita molti membri della gang del Joker, trasferiti dopo un incendio al Blackgate Prison. Credendo che il Joker si sia fatto catturare, Batman lo accompagna nell'Arkham Asylum. Il piano del Joker si rivela quando Harley Quinn prende il controllo della sicurezza e il Joker scappa all'interno della struttura, aiutato da una guardia corrotta che rapisce Commissioner Gordon. Il Joker minaccia di far detonare delle bombe nascoste in giro per Gotham City se qualcuno cercherà di entrare all'Arkham, costringendo Batman a lavorare da solo. Inseguendo Quinn fino alla struttura medica per salvare Gordon, Batman è esposto alla tossina della paura di Scarecrow e ha allucinazioni, vedendo la morte di Gordon e i corpi dei suoi genitori che gli parlano. Dopo aver respinto Scarecrow, Batman trova e mette a tacere Quinn prima di salvare Gordon. Il Joker poi guida Batman verso il Bane catturato, che è stato sottoposto a esperimenti dalla dottoressa Penelope Young. Il Joker libera Bane e Batman è costretto a fronteggiarlo, durante il quale Quinn riesce a fuggire. Successivamente, va in un'installazione segreta della Batcave che aveva nascosto sull'isola, dove Batman rifornisce i suoi gadget. Lì, Batman apprende che il Joker è tornato all'Arkham Asylum per ottenere l'accesso a Young, che sta sviluppando Titan — una versione più potente della droga Venom che conferisce a Bane la sua forza — con l'intento di usarla per aiutare i pazienti a sopravvivere a terapie più faticose. Young aveva scoperto che il Joker aveva finanziato la sua ricerca per creare un esercito di scagnozzi superumani; il suo rifiuto di consegnare la formula ha precipitato il ritorno del Joker all'Asylum. Mentre cerca Young, Batman viene di nuovo attaccato da Scarecrow e dalla tossina della paura, e ha allucinazioni sulla notte della morte dei suoi genitori. Dopo essersi ripreso, Batman distrugge la formula Titan di Young e salva Young da Victor Zsasz. Un'esplosione uccide Young e il Joker ottiene i lotti completi di Titan. Nel Penitenziario, Quinn libera Poison Ivy dalla sua cella prima di essere imprigionata da Batman. Quinn rivela accidentalmente che il Joker ha un impianto di produzione Titan nei giardini botanici di Arkham. Batman viaggia lì e scopre che Titan è creato da piante geneticamente modificate. Chiama l'aiuto di Ivy per creare un antidoto e scopre che può essere prodotto solo da spore trovate esclusivamente nella tana di Killer Croc in una fogna. Sulla strada verso Croc, Batman viene di nuovo attaccato da Scarecrow e supera diverse dosi di tossina della paura. Nel frattempo, il Joker inietta Titan in Ivy, potenziandone i poteri. Ivy inizia a devastare Arkham Island con giganti piante mutanti. Inseguito da Batman nella tana di Croc, Scarecrow viene attaccato da Croc e trascinato sott'acqua. Batman recupera le spore necessarie e mette a tacere Croc prima di tornare alla Batcave, ma riesce a sintetizzare solo una dose di antidoto prima che le piante di Ivy irrompano nella caverna e distruggano la sua attrezzatura. Batman torna ai giardini botanici e sconfigge Ivy, fermando le piante impazzite. Il Joker annuncia che i preparativi per la sua festa sono finalmente completi e Batman si dirige al centro visitatori dell'Arkham Asylum, dove i suoi scagnozzi applaudono lo accolgono. Il Joker rivela di aver ricatturato Gordon e prova a sparargli con un dardo pieno di Titan; Batman interviene in difesa di Gordon e viene colpito lui. Batman cerca di resistere al cambiamento, e un Joker turbato prende un'overdose di Titan, mutando in un enorme mostro. In un'arena improvvisata sul tetto dell'edificio, il Joker sfida Batman a un combattimento mentre mostri indotti da Titan si aggirano davanti agli elicotteri delle notizie. Batman si rifiuta di trasformarsi, usa l'antidoto su se stesso e sconfigge il Joker afflitto dalla Titan e i suoi scagnozzi, stendendo il suo nemico con un pugno potenziato da gel esplosivo. Dopo l'accaduto, coloro che sono stati affetti da Titan iniziano a tornare alla normalità, incluso il Joker, che viene trattenuto e messo in custodia mentre la polizia riprende l'Asylum. Batman intercetta una chiamata riguardante un crimine guidato da Two-Face in corso e torna volando a Gotham City a bordo del Batwing. In una scena post-credits, una cassa di formula Titan galleggia nell'oceano vicino all'Arkham Asylum quando compare una mano e la afferra.