Il gameplay principale si ispira liberamente ai seguenti episodi della prima stagione: "Things Change", "A Better Mouse Trap", "Attack of the Mouser"s, "Meet Casey Jones", "Nano", "Darkness on the Edge of Town", "The Way of Invisibility", "Notes From the Underground" (Parti 1-3) e "Return to New York" (Parti 1-3), oltre a un livello che non deriva affatto dalla serie animata. Poco tempo dopo che un gruppo di robot Mouser ha distrutto la vecchia casa delle tartarughe, esse iniziano a cercarne una nuova. Michelangelo finisce per mettere sui nervi Raphael, costringendo Raphael ad andare in superficie. In superficie, viene affrontato da teppisti della Purple Dragon, Casey Jones e Dragonface. Baxter Stockman presto usa ninjas della Foot Tech invisibili per catturare Raphael, e Donatello è costretto a salvarlo. Successivamente, mentre Raphael e Michelangelo si sfidano per divertimento, Donatello analizza un cristallo strano che ha trovato nella loro casa, notando che sembrano cellule cerebrali mutate. Raphael dà un calcio a Michelangelo contro un muro, rivelando un grande tunnel dietro di esso. I cristalli che Donatello ha trovato iniziano a brillare e le tartarughe decidono di indagare. Seguono il tunnel e vengono affrontati da esseri umani geneticamente mutati. Dopo alcuni scontri con questi mutanti, le tartarughe scoprono che tali mutanti sono stati trasformati nel loro stato attuale da esperimenti passati degli scienziati di Shredder. I cristalli che Donatello ha trovato sono l'unico elemento in grado di mantenere in vita questi mutanti, e perciò non possono lasciare la loro casa sotterranea. Chiedono alle tartarughe di sconfiggere Shredder, affinché nessun altro essere umano soffra come hanno fatto loro. Le tartarughe decidono di sconfiggere Shredder una volta per tutte, e promettono ai mutanti che torneranno da loro se mai troveranno un modo per invertire la loro condizione.